ALSTEM是一家位于灣區的早期生物技術公司，擁有快速擴展的產品和服務組合，為生物制藥和學術機構提供服務。受到加利福尼亞干細胞研究承諾的啟發，ALSTEM于2012年由具有iPS細胞重編程和基因組編輯技術專業知識的科學家創立。

ALSTEM VP200說明書

Retroviral Packaging Mix: #VP200

逆轉錄病毒包裝混合物：＃VP200

描述

逆轉錄病毒包裝混合物提供了一種快速方便的方法，用于產生高滴度的無復制能力的逆轉錄病毒。這種基于Moloney鼠白血病病毒（MMLV）的包裝系統擁有您的靶細胞所需的理想宿主范圍。它是一種即用型逆轉錄病毒包裝混合物，含有VSVG，僅需48小時即可產生高滴度的逆轉錄病毒。這些必需的病毒結構基因的單獨表達通過小化細胞分裂過程中產生的風險并降低產生具有復制能力的病毒的機會來確保對重組構建體的安全性和控制。

• 概觀

逆轉錄病毒包裝混合物是用于產生高滴度泛熱反轉錄病毒的優化配方。

• 通過瞬時轉染實現10 ^7個感染單位/ ml的平均滴度
• 簡單共轉染逆轉錄病毒包裝混合物和含有您感興趣的基因的表達載體
• 產生自我失活的泛熱反轉錄病毒

第1天：

1.在10cm培養皿中培養293T細胞（每10cm培養皿約4×10 ^6個細胞）。

第2天：

2.檢查以確保細胞達到70-80％匯合。

3.對于每個10cm培養皿，準備轉染復合物如下：

一個。1.5ml試管A：在0.5ml無血清培養基（例如DMEM）中稀釋7.5μgDNA質粒和15μl逆轉錄病毒包裝混合物。通過移液混合。

灣 1.5ml離心管中B：稀釋NanoFect的45μL ^TM轉染試劑在0.5ml無血清培養基中并輕輕混合。

C。將NanoFect / DMEM添加到DNA / DMEM溶液中。通過渦旋混合5-10秒，然后在室溫下孵育DMEM-質粒-NanoFect混合物15分鐘。

4.將來自步驟3的完整轉染復合物逐滴添加至細胞，并旋轉培養皿以將轉染復合物均勻地分散在平板中。

5.將板在37°C孵育過夜。

第3天：

6.用10ml新鮮培養基更換上清液。

注意：您可以用20μlTiterMax（500X，ALSTEM，目錄號VB100）補充培養基，以提高病毒滴度。

7.在37°C孵育24小時。

第4天（1 ^ST收獲）：

8.將含有逆轉錄病毒的上清液收集到50ml無菌帶蓋的錐形離心管中。

9.在4℃下以3000rpm離心上清液15分鐘以沉淀細胞碎片。

10.通過低蛋白結合0.45-μm無菌過濾器過濾澄清的上清液。

11.病毒已準備好進行感染，純化，或者可以在-80°C下作為病毒原液儲存，以備將來使用。等分體積優選用于儲存以降低凍融循環中的病毒滴度損失。

12.如果需要第二次收獲，在次收獲后向細胞中加入10ml*培養基，并將培養皿放回37℃培養箱中。

注意：您可以用20μlTiterMax（500X，ALSTEM，目錄號VB100）補充培養基，以提高病毒滴度。

第5天（^第二次收獲）

13.第二次收獲可在第5天完成，步驟8-11之后。

14.為了濃縮病毒，將1體積的逆轉錄病毒濃縮溶液（ALSTEM，cat.no.VC200）加入到4體積的病毒上清液中，并充分混合。

15.將混合物置于4°C冰箱中過夜，第二天將病毒沉淀。有關詳細信息，請參閱用戶手冊。

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