arthusbio甲硫氨酸說(shuō)明書

貨號(hào)：1K00201

規(guī)格： 96 tests

Detection range 15nM - 480n

arthusbio 1K00201

甲硫氨酸是一種具有硫甲基的氨基酸，通過(guò)甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（EC 2.5.1.6）與ATP一起轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。SAM是50多種生物活性物質(zhì)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷脂、激素和神經(jīng)遞質(zhì)等）的甲基供體。甲基在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下從SAM轉(zhuǎn)移后，形成S-腺苷高半胱氨酸，去除腺苷后進(jìn)一步代謝為同型半胱氨酸（Hcy）。同型半胱氨酸通過(guò)N5甲基四氫葉酸甲基轉(zhuǎn)移酶（EC1.1.1.68）和輔酶維生素B12催化途徑從N5甲基四氫葉酸接受甲基代謝為甲硫氨酸。這是蛋氨酸循環(huán)。

甲基化指數(shù)定義為SAM和SAH的比率。甲基化指數(shù)\是甲基化狀態(tài)和甲基化能力的更好標(biāo)記。

SAM用作治療抑郁癥、肝病、關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)痛等的藥物或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。

該免疫分析試劑盒用于測(cè)量可溶性樣品中SAM的水平。

測(cè)定原理

這種直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）旨在測(cè)量樣品中S腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的水平。將與大分子偶聯(lián)的SAM固定在微量滴定板上。用移液管將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品注入井中，

然后添加針對(duì)SAM的HRP結(jié)合抗體。樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的游離SAM分子與微滴度板表面上的固定化SAM競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)。丟棄混合溶液并清洗每個(gè)孔后，添加TMB基質(zhì)溶液。基質(zhì)溶液在HRP（辣根過(guò)氧化物酶）的作用下變藍(lán)，添加停止溶液（酸）后變黃。顏色與樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）中SAM的量成反比。使用微板分光光度計(jì)在450nm處測(cè)量剩余溶液（OD450）的光密度。樣品中SAM的水平可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算。

樣品收集和儲(chǔ)存

1、樣品采集必須在4℃下進(jìn)行。必要時(shí)，通過(guò)離心去除沉淀，并盡快測(cè)試樣品或?qū)⑵鋬?chǔ)存在-20°C或以下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

2.避免樣品中的NaN3，因?yàn)樗鼤?huì)使辣根過(guò)氧化物酶（HRP）失活。

3、一些未知因素可能會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生影響（基質(zhì)效應(yīng)）。用樣品稀釋劑稀釋樣品或用與實(shí)際樣品基質(zhì)相同的基質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)品/樣品，這應(yīng)避免或減少基質(zhì)效應(yīng)。

程序

1、將所有試劑重新加熱至室溫，并充分混合。取出適當(dāng)數(shù)量的井，將剩余的井放回

拉鏈。密封Ziploc并將其儲(chǔ)存在-20°C。

2、向每個(gè)孔中加入30ul樣品稀釋劑（空白孔）、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。

3、制備HRP結(jié)合抗體溶液：用HRP抗體稀釋液按1:600稀釋HRP抗體，在wek內(nèi)用完。

如果一周后使用，請(qǐng)?jiān)谛枰獣r(shí)準(zhǔn)備。充分混合并儲(chǔ)存在黑暗中。

4、向每個(gè)孔中加入70ul HRP結(jié)合抗體，空白孔除外。

5、將平板置于振蕩器上，搖動(dòng)一段時(shí)間，使試劑混合，然后用微孔板封閉劑密封平板。將平板在37°C下培養(yǎng)1小時(shí)。

6、小心剝離密封劑，并將剩余溶液丟棄在孔中。在每個(gè)孔中添加至少300ul洗滌液，并保持該狀態(tài)30秒，然后去除洗滌液。重復(fù)這些步驟3次以完成清洗過(guò)程。或者改用自動(dòng)清洗機(jī)。

7、向每個(gè)孔中添加TMB基質(zhì)和100ul混合基質(zhì)。輕輕搖晃并密封盤子。將培養(yǎng)板在37°C下無(wú)光培養(yǎng)15分鐘。

8、在反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入50ul停止溶液。

9.在15分鐘內(nèi)測(cè)量每個(gè)孔在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度。根據(jù)空白井設(shè)置零。

數(shù)據(jù)處理

始終通過(guò)從測(cè)試孔的吸光度中減去空白孔450 nm（OD450）處的吸光度來(lái)清除背景。

每個(gè)孔（標(biāo)準(zhǔn)或樣品）的吸收率等于AAso，A是標(biāo)準(zhǔn)孔或樣品孔的平均吸光度，Aso是So標(biāo)準(zhǔn)孔的平均吸光度。創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：通過(guò)繪制每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品在y軸上的結(jié)合率與其在x軸上濃度的對(duì)數(shù)來(lái)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用二次多項(xiàng)式曲線對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行傅立葉變換（r>0.99）。樣本的SAM水平可以通過(guò)將其結(jié)合率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程來(lái)計(jì)算。如果樣品已稀釋，則乘以稀釋程度。

筆記

1、使用未重新加熱的試劑和樣品或環(huán)境溫度低于20°C可能導(dǎo)致OD450值降低。

2、額外的干燥后洗滌可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響，例如標(biāo)準(zhǔn)曲線和重復(fù)性較差。為了避免這種情況，請(qǐng)?jiān)谇逑春罅⒓磮?zhí)行下一步。

3、充分混合溶液并*清洗，因?yàn)檫@些程序會(huì)影響分析。

4、用微板封閉劑密封板，孵育板時(shí)避光。

5、推薦標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的重復(fù)井，建議標(biāo)準(zhǔn)曲線傅里葉變換采用二次多項(xiàng)式（r>0.99）。這個(gè)

質(zhì)控瓶的檢測(cè)濃度應(yīng)在檢測(cè)范圍內(nèi)。

6、由于基質(zhì)效應(yīng)，樣品孔的吸光度可能高于S0標(biāo)準(zhǔn)孔的吸光度。在這種情況下，將樣品稀釋至少十倍。如果在10倍稀釋后無(wú)法檢測(cè)SAM水平，則使用與待測(cè)量樣品相同的矩陣來(lái)制備一組新的標(biāo)準(zhǔn)并再次測(cè)量。

7、濃縮洗滌液可能結(jié)晶。加熱，使鹽在稀釋前*溶解。

8、微孔板密封劑應(yīng)一次性使用，以避免交叉污染。

9、基板應(yīng)避光。

10、停止溶液為稀硫酸。避免直接接觸皮膚和其他物品。

存儲(chǔ)和有效日期

儲(chǔ)存條件：除HRP基質(zhì)和停止溶液儲(chǔ)存在2-8℃外，所有其他成分和板條均可冷凍儲(chǔ)存。

有效期：自裝運(yùn)之日起冰箱儲(chǔ)存約6個(gè)月。如果不打算很快使用，用戶可以將分析板，

HRP抗SAM抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP抗體和樣品稀釋液在冷凍柜中儲(chǔ)存更長(zhǎng)時(shí)間或/和更好的結(jié)果。