amquar.達(dá)克珠單抗

Daclizumab（達(dá)珠單抗高產(chǎn)法）是一種人源化單克隆抗體，可與白細(xì)胞介素-2受體的α-亞基（CD25）結(jié)合，有利地調(diào)節(jié)多發(fā)性硬化癥（MS）的免疫環(huán)境。

目錄號(hào)

MA1018

純度

> 97％的

規(guī)格

2毫克/毫升

• 生物活性

   

  Daclizumab（達(dá)珠單抗高產(chǎn)法）是一種人源化單克隆抗體，可與白細(xì)胞介素-2受體的α-亞基（CD25）結(jié)合，有利地調(diào)節(jié)多發(fā)性硬化癥（MS）中的免疫環(huán)境。

  達(dá)克珠單抗與CD25的結(jié)合，Kd值為4.5nM。[1]

  Daclizuma在體外抑制IL-2依賴的KIT225 / K6細(xì)胞增殖，IC50為3.14nM [1]。

   

• 體外研究

   

• 體內(nèi)研究

   

• 激酶實(shí)驗(yàn)

   

  使用表面等離子體共振進(jìn)行等離子體共振結(jié)合表征[1]

   

  抗體結(jié)合特性werecharacterized以確定針對(duì)可溶性，重組人IL-2R的結(jié)合相互作用速率常數(shù)（ka和KD）和親和常數(shù)（KD） α 使用Biacore技術(shù)（CD25）。使用伯胺共價(jià)偶聯(lián)化學(xué)將每種抗體材料固定在芯片表面上。使用自動(dòng)方法以不同濃度一式兩份和參照表面注射重組CD25 2分鐘。使用參考流動(dòng)池和緩沖液空白校正結(jié)合數(shù)據(jù)。使用新制備的傳感器表面復(fù)制測(cè)定，然后使用二價(jià)模型將結(jié)合數(shù)據(jù)與BIAevaluation軟件擬合以獲得用于動(dòng)力學(xué)評(píng)估的平衡常數(shù)。

   

   

• 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

   

  細(xì)胞培養(yǎng)和效應(yīng)細(xì)胞的分離[1]

   

  使用基于細(xì)胞的方法測(cè)定直接抑制IL-2依賴性高親和力IL-2受體介導(dǎo)的增殖的相對(duì)抗體生物學(xué)效力，該方法評(píng)估滴定的抗體濃度對(duì)人白血病細(xì)胞系KIT225 / K6.28 PBMC增殖的影響。用Ficoll-PaqueTM Plus密度梯度分離并用作ADCC測(cè)定中的效應(yīng)細(xì)胞。在另外的ADCC實(shí)驗(yàn)中，分別使用針對(duì)CD14和CD56的EasySepTM人CD34陽性選擇試劑盒從PBMC培養(yǎng)物中除去單核細(xì)胞和NK細(xì)胞，并使用RobosepTM自動(dòng)細(xì)胞分離系統(tǒng)的制造商方案。通過流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)靶細(xì)胞消耗大于95％。所有血液均來自知情同意的健康志愿者，并且未對(duì)個(gè)體供體進(jìn)行基因分型。

  ⁵¹ Cr標(biāo)記靶細(xì)胞

  KIT225 / K6細(xì)胞在RPMI 1640*培養(yǎng)基（10％熱滅活的胎牛血清加補(bǔ)充物）中生長(zhǎng)。KIT225 / K6cells以2×10的終濃度懸浮在0.5毫升試驗(yàn)培養(yǎng)基（RPMI 1640,10％熱inactivatedfetal牛serumplus補(bǔ)充劑）^7個(gè)細(xì)胞/ mL，并用500標(biāo)記的 μ 次的⁵¹鉻（50 μ 次/ 10 ⁶個(gè)細(xì)胞）在37溫育^Ô在水浴中1個(gè)小時(shí)withoccasional混合℃。用12mL AssayMedium洗滌標(biāo)記的細(xì)胞4次。使用Beckman Gamma5500B計(jì)數(shù)器靶標(biāo)記的效率進(jìn)行評(píng)價(jià)，并認(rèn)為是可接受的，如果有在least20,000 CPM / 10的活動(dòng)⁵細(xì)胞。標(biāo)記的靶細(xì)胞在測(cè)定培養(yǎng)基中以2.5×10 ⁵細(xì)胞/ mL的細(xì)胞密度懸浮，或在CDC測(cè)定培養(yǎng)基中以5.0×10 ⁵細(xì)胞/ mL懸浮，視情況而定。

  補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性測(cè)定

  將抗體在含有RPMI 1640,0.1％BSA和10mM HEPES的CDC AssayMedium中連續(xù)稀釋。50 μ 洛夫⁵¹ Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞（25,000cells /孔）加入到wellsof amicrotiter U型底96孔板中，然后在50體積 μ 加入測(cè)試抗體的LOF系列稀釋。25 μ 升8％的Triton X-100的and25 μ CDC分析培養(yǎng)基升加入到大釋放孔中，并50 μ LOF CDC分析培養(yǎng)基加入到自發(fā)釋放的孔（一式四份）。50 μ LOF 1/3稀釋度的人血清池的溶液中加入于參考和testsample井。三分之一稀釋的熱滅活的（30分鐘將50ml在56 ^öC）將人合并的血清加入補(bǔ)體非依賴性對(duì)照，大釋放和自發(fā)釋放孔中。通過鑒定特異性活性大的濃度而非特異性活性小化來預(yù)先建立宜的人合并血清濃度。測(cè)定板incubatedfor 2小時(shí)，在37 ^Ô在7.5％CO c ^ ₂培養(yǎng)箱然后紡at350 RCF在室溫下5分鐘。75的體積 μ LOF上清液轉(zhuǎn)移托米尼管，和eachmini-管插入intoa閃爍小瓶中并計(jì)數(shù)1分鐘在Beckman伽瑪5500B計(jì)數(shù)器，或等同物。匯集的人血清使用靜脈穿刺和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從Quidel Corporation或健康志愿者獲得。

  用于CDC活性的陽性對(duì)照抗體是人源化IgG1 / k抗體Hu＃4，其對(duì)于跨HLA-DR具有結(jié)合特異性。用于CDC和ADCC活性的陰性對(duì)照抗體具有對(duì)HSV病毒抗原具有結(jié)合特異性的人源化IgG1 / k抗體HuFd79。報(bào)告為百分比特異性裂解的值使用以下公式得出：特異性裂解百分比=（（抗體治療計(jì)數(shù)每分鐘（CPM） - 自發(fā)性CPM）/（大CPM - 自發(fā)性CPM））×100。

  抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性測(cè)定

  ⁵¹鉻labeledKIT225 / K6細(xì)胞（12500個(gè)細(xì)胞/孔）預(yù)溫育以1:1的fixedconcentration μ克/毫升的mAb（用于可變效應(yīng)物與靶[E：T]比率格式）orvarious劑量（5,1，0.2 ，0.04％，0.008，和0.0016 μ克/毫升）的mAb（用于可變抗體濃度格式）處理30分鐘，在4 ^Ó在100體積CIN V-bottom96-孔板 μ大號(hào)AssayMedium的。將對(duì)照細(xì)胞與單獨(dú)的測(cè)定培養(yǎng)基（無mAb）一起溫育，隨后確定自發(fā)和大⁵¹ Cr釋放，以及抗體非依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（AICC）。將PBMC（效應(yīng)子）在分析培養(yǎng)基中，在單獨(dú)的96孔聚丙烯板中連續(xù)稀釋，產(chǎn)生6.25×10的濃度。^5個(gè)細(xì)胞/ 100 μ L，3.13x 10 ⁵細(xì)胞/ 100 μ L，1.56×10個(gè)⁵細(xì)胞/ 100 μ L，7.81x 10 ⁴細(xì)胞/ 100 μ L，3.91×10個(gè)⁴細(xì)胞/ 100 μ L. 100 μ LPER PBMC懸浮液的孔中轉(zhuǎn)移到變量E：含有T比assayplate ⁵¹ Cr標(biāo)記的KIT225 / K6 + 1 μ克/毫升的mAb，得到E：的T比50：1，25：1，12.5：1，6.25： 1和3.13：1。到variableantibody濃度測(cè)定板，將PBMC稀釋至3.13£106細(xì)胞/ 100 μ Land100 μ每孔加入到試驗(yàn)孔中升。100 μ將單獨(dú)的Assay培養(yǎng)基中的L（無效應(yīng)物）加入到⁵¹ Cr標(biāo)記的KIT225 / K6C mAb中，以確定⁵¹ Cr的自發(fā)和大釋放。Theassay平板在50 RCF離心2分鐘，并在37℃培養(yǎng)^Ô CIN 7.5％CO ₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。4國(guó)稅發(fā)小時(shí)培養(yǎng)結(jié)束前30分鐘，25體積 μ tothe適當(dāng)?shù)膶?duì)照孔中加入L 8％的TritonX-100的確定的大釋放^51個(gè) Crfrom靶細(xì)胞。ADCC活性的陽性對(duì)照抗體是對(duì)HLA-DR b鏈具有結(jié)合特異性的人源化IgG1 / k抗體Hu1D10。

  抑制IL-2依賴性增殖

  使用需要IL-2增殖的人KIT225 / K6細(xì)胞系測(cè)定Zenapax和DAC HYP的相對(duì)效力。在微量滴定組織培養(yǎng)板中在IL-2存在下針對(duì)單位體積的細(xì)胞滴定抗體，并使用530nm激發(fā)和590nm發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定Alamarblue的減少。通過繪制相對(duì)熒光單位對(duì)log10濃度來確定陽性。產(chǎn)生S形曲線的值，并使用SoftMax Pro 4.3軟件中的4參數(shù)擬合進(jìn)行評(píng)估。

  

   

   

• 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

   

  ATL的小鼠模型[2]

   

  ATL細(xì)胞群MET-1從患有急性ATL的患者的外周血中建立，并且通過NOD / SCID小鼠中的連續(xù)轉(zhuǎn)移維持細(xì)胞。MET-1細(xì)胞具有通過熒光激活細(xì)胞分選分析闡明的暗色表型：CD3 ^dim，CD4 ^{+ /} - ，CD7 ^-，CD20 ^{- 和} CD25 ⁺。通過腹膜內(nèi)注射1.5×10 ⁷ MET-1細(xì)胞到NOD / SCID小鼠中建立白血病模型。當(dāng)這些小鼠的血清可溶性IL-2R- α （sIL- 2R- α ）水平超過1000pg / mL時(shí)，對(duì)這些小鼠進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)，這在腫瘤接種后約10至14天發(fā)生。

  大耐受劑量的定義

  在開始治療研究之前，在NOD / SCID小鼠中測(cè)定大耐受劑量的縮酚酸肽。每天通過腹膜內(nèi)施用每千克體重0.125,0.25,0.5,1.0和2.0mg縮酚酸肽的劑量，持續(xù)2周。2.0mg / kg組中的所有小鼠在第7天死亡，并且1.0mg / kg組中80％的小鼠在第14天死亡。在0.5,2.25和0.125mg / kg組中的小鼠在注射縮酚肽后6個(gè)月是stillalive 。因此，選擇用于治療試驗(yàn)的劑量為0.5mg / kgevery14天，持續(xù)14天; 這與其他研究人員在小鼠中使用的結(jié)果一致。

  Therapystudy

  在攜帶MET-1白血病的小鼠中進(jìn)行治療性研究，在小腫瘤負(fù)荷試驗(yàn)中血清替代腫瘤標(biāo)志物sIL-2R- α 值為1000至10000μg / mL，在大腫瘤負(fù)荷試驗(yàn)中為10000至25000pg / mL 。在治療試驗(yàn)中有5組。組1中，縮酚酸肽組，接收的0.5mg的縮酚酸肽/ kg體重2 weeks.Group 2每隔一天，免疫治療（達(dá)珠單抗）基團(tuán)，被賦予靜脈injectionsof腹腔注射100 μ 克達(dá)珠單抗在第0，7，14，組3，聯(lián)合治療組，接受縮酚酸和達(dá)利珠單抗的聯(lián)合治療（給藥方案如組1加組2）。第4組收到 200μ每周一次PBS，持續(xù)4周，并作為對(duì)照。第5組，沒有腫瘤和沒有治療，作為NOD / SCID小鼠自然死亡的對(duì)照。在小腫瘤負(fù)荷治療試驗(yàn)中每組有13只小鼠（sIL- 2R - α ，1000-10 000 pg / mL），在大腫瘤負(fù)荷中每組有8只小鼠（sIL-2R- α ，10 000- 25 000 pg / mL）。這些組被隨機(jī)分配并且在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)具有替代腫瘤標(biāo)記物sIL-2R- α的可比較的平均水平。

  監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)

  的血清濃度國(guó)稅發(fā)可溶性IL-2R-的測(cè)量 α 或可溶性 β 2 -微球蛋白（ β 2 μ ）用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定進(jìn)行。根據(jù)制造商的建議進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。

  

   

  

   

• 不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依據(jù)體表面積的等效劑量轉(zhuǎn)換表（數(shù)據(jù)來源于FDA指南）

   

   

  動(dòng)物 A (mg/kg) = 動(dòng)物 B (mg/kg)×動(dòng)物 B的Km系數(shù)/動(dòng)物 A的Km系數(shù)

   

  例如，已知某工具藥用于小鼠的劑量為88 mg/kg , 則用于大鼠的劑量換算方法：將88 mg/kg 乘以小鼠的Km系數(shù)（3），再除以大鼠的Km系數(shù)（6），得到該藥物用于大鼠的等效劑量44 mg/kg。

• 參考文獻(xiàn)

  [1] Ganguly，B。; Balasa，B。; Efros，L。; 公主Hinton; Hartman，S。; Thakur，A。; 熊，JM; 施密特，B。; 羅賓遜，RR; Sornasse，T。; Vexler，V。; Sheridan，JP，與Zenapax相比，CD25結(jié)合抗體Daclizumab High-Yield Process具有*的糖基化模式和降低的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。MAbs 2016,8（7??），1417-1424。
  [2] Chen，J。; 張，M。; Ju，W。; Waldmann，TA，使用縮酚肽及其與針對(duì)CD25的未修飾的達(dá)珠單抗的組合有效治療成人T細(xì)胞白血病的鼠模型。Blood 2009,113（6），1287-93。

  分子式	分子量	CAS號(hào)	儲(chǔ)存方式 -80 ℃長(zhǎng)期儲(chǔ)存。干冰運(yùn)輸
  溶劑（常溫）	DMSO	水	乙醇

  體內(nèi)溶解度

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